[摘要] 目的：优选藏药六味明目丸的提取工艺。方法：采用正交试验法，以盐酸小檗碱和出膏率为指标，考察提取时间、提取次数和加水量三个因素对六味明目丸提取工艺的影响，优选最佳工艺。结果：优选工艺为加水提取2次，每次加6倍量提取2小时。结论：优选的工艺简单，合理，适合工业化生产。
[关键词] 六味明目丸；盐酸小檗碱；出膏率；正交试验
[中图分类号]R286 [文献标识码]A
Optimize the Extraction Process of Tibetan medicine Liuwei Mingmu Pill by Orthogonal Test
[Abstract] Objective: To optimize the extraction process of Tibetan medicine Liuwei Mingmu Pill. Methods: The effects of extraction time, extraction times and water amount on the yield of extract were evaluated by orthogonal test with total of berberine indices. Results: Orthogonal design method indicates that the most optimized technique：6 times of water as amount, 2 times to be extracted, 2 hours for each time. Conclusion: The method is simple, reasonable, and suitable for industrialized production.
[key words] Liuwei Mingmu Pill; Berberine hydrochloride; Yield rate; Orthogonal test.
六味明目丸为经典藏医眼科制剂，系金诃藏药股份有限公司独家产品，由制铁粉、小檗皮、藏茴香、诃子、毛诃子、余甘子等组成。藏医认为该药具有调节查赤，清热消朦，养肝明目的功效，用于查赤引起的目赤羞明、迎风流泪、视物模糊。中医认为该药具有清热泻火，平肝明目的功效，可用于肝火上炎所致的目赤肿痛、羞明流泪、视物不清等。现行药品标准的六味明目丸为药材全药粉入药，卫生学指标难以控制，不适合工业化生产，患者服药量较大，因此，我们采用正交试验法，以盐酸小檗碱和出膏率为考察指标，对处方中药材的提取工艺进行了初步考察，为该品种进行技术革新奠定了良好的基础。
1 材料
六味明目药材均由金诃藏药股份有限公司提供；盐酸小檗碱（中国食品生物制品检定所，110713-201110，供含量测定用）；日立L-2100型高效液相色谱仪（日立公司）； RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2 提取工艺研究
六味明目丸中的小檗皮、诃子、毛诃子和余甘子均含有水溶性有效成分。诃子为“藏药之王”，与毛诃子和余甘子的配伍组合在诸多藏药方剂中出现，被称为藏药三果，是处方的重要组成部分，含有丰富的鞣质和三萜类成分，有效物质成分复杂[1]。小檗皮为藏药常用药材，常用于陈旧黄水病及一切眼病的治疗。小檗皮主要药效活性成分为盐酸小檗碱[2]，与藏药三果比较，活性成分明确。水提工艺中，药材出膏率常常用作工艺选择的辅助因素。因此，我们采用正交试验法，以小檗皮中盐酸小檗碱的提取量为主要考察指标，辅以药材出膏率，考察上述4味药材的提取工艺。
2.1 因素水平的测定：以加水量、提取时间、提取次数为因素，因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平表
水平 因素
A提取时间（h） B提取次数（次） C加水量（倍） D 空白
1 1 1 6 ---
2 2 2 8 ---
3 3 3 10 ---
2.2 提取方法：按处方比例，取小檗皮11.1g、诃子5.6g、毛诃子5.6g、余甘子5.6g，共4味总计27.9g，共9份，按照正交试验设计条件进行处理，提取液分别浓缩至100mL，备用。
2.3 盐酸小檗碱的HPLC测定[3-4]
2.3.1 色谱条件：色谱柱：Waters C18柱（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：甲醇-醋酸溶液（含0.2%三乙胺与0.2%冰醋酸，pH为4）（30:70）；流速：1mL/min；检测波长：346nm；柱温：室温；理论板数按盐酸小檗碱计算应不低于3000。
2.3.2 对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品9.83mg，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取2mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3.3 供试品溶液的制备：精密量取2.2项下的备用浓缩液1mL，加甲醇稀释至25mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算，即得。
2.4 出膏率的测定：精密量取2.2项下的备用浓缩液25mL，水浴蒸干，干燥至恒重，计算出膏率，即得。
2.5 结果：以盐酸小檗碱的提取量为主要考察指标，权重系数为0.7，以出膏率为辅助考察指标，权重系数为0.3，对每份样品综合评分，计算公式如下：
综合得分=（盐酸小檗碱提取量/最大含量）×0.7×100+（出膏率/最大量）×0.3×100
正交试验结果见表2，方差分析见表3。
表2 正交试验结果
水
平 因素 盐酸小檗碱提取量(mg) 出膏率（%） 综合评分
A B C D
1 1 1 1 1 135.57 13.68 78.62
2 1 2 2 2 131.46 23.87 88.27
3 1 3 3 3 134.38 20.33 85.62
4 2 1 2 3 130.92 22.70 86.70
5 2 2 3 1 135.33 26.43 92.98
6 2 3 1 2 145.32 22.77 93.48
7 3 1 3 2 132.00 21.71 86.07
8 3 2 1 3 150.41 19.81 92.49
9 3 3 2 1 147.24 21.10 92.47
K1 252.51 251.39 264.59 264.07
K2 273.16 273.74 267.44 267.82
K3 271.03 271.57 264.67 264.81
k1 84.170 83.797 88.197 88.023
k2 91.053 91.247 89.147 89.273
k3 90.343 90.523 88.223 88.270
R 6.883 7.450 0.950 1.250
注：表中Ki表示与某因素的i水平有关的综合评分之和（i=1,2,3）；ki表示某因素的i水平综合评分的平均影响程度，该指标值越大越好（i=1,2,3）；R表示某因素不同水平之间的极差，反映了该因素对两个评价指标综合评分的影响大小。
表3 方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 85.994 2 43.00 32.58 *
B 101.274 2 50.64 38.36 *
C 1.756 2 0.88 0.67
D 2.630 2 1.32 -- --
注：F0.05(2，2) =19.00，F0.01（2,2）=99.00，*表示有显著性影响。
由表2可知，极差最大的为B因素提取次数，其次为提取时间，三个因素综合评分的影响排序是：B＞A＞C。表3方差分析显示，A因素提取时间和B因素提取次数对试验结果有显著性影响。由各因素水平的高低选取最佳提取工艺条件为A2B2C2，即提取2次，每次加8倍量水提取2小时。因为C因素加水量的影响差异性不大，且处方中没有吸液量较大的药材，因此，从经济角度考虑，选择A2B2C1工艺，即提取2次，每次加6倍量水提取2小时。
2.6 验证试验
为验证最佳提取工艺的稳定性，取小檗皮11.1g、诃子5.6g、毛诃子5.6g、余甘子5.6g，共4味总计27.9g，共6份，其中3份加8倍量水，另外3份加6倍量水，分别提取2次，每次提取2小时，合并提取液，并浓缩至100mL，测定盐酸小檗碱提取量和出膏率。由验证试验可知，优选工艺与最佳工艺的盐酸小檗碱提取量和出膏率均差别不大，与正交试验中的分析是一致的，因此确定优选的提取工艺为提取2次，每次加6倍量水提取2小时。结果见表4。
表4 验证试验
提取工艺 盐酸小檗碱提取量（mg） 平均值（mg） 出膏率（%） 平均值（%）
A2B2C2 141.32 141.09 26.57 26.42
140.09 26.60
141.85 26.09
A2B2C1 140.63 140.89 26.34 26.14
141.08 26.19
140.97 25.88
3 讨论
3.1 传统的六味明目丸为全药粉入药，我们根据药材所含植化成分的性质，进行了提取工艺的研究，并将提取物制成丸剂，临床实验证明与全药粉入药的六味明目丸相比，产品的总有效率有所提高（将另文报道），说明本试验优选的工艺合理可行。
3.2 在提取工艺研究中，曾以没食子酸的含量作为一个考察指标，但试验中发现，提取时，伴随有没食子酸与其他成分的相互转化。而小檗皮的临床疗效及有效成分均非常明确，因此选择以盐酸小檗碱作为主要考察指标。
参考文献
[1] 姚喆，泽翁拥忠，德洛，等. 藏药三果汤散化学与药理研究进展[C]. 全国第三届药用植物化学与中药新药研发技术创新研讨会，2010：25-32.
[2] 子巴. HPLC法测定不同产地藏药小檗皮中盐酸小檗碱含量比较[J]. 四川中医，2011，29（9）：45-46.
[3] 陈海娟. HPLC法测定六味明目丸中小檗碱的含量[J]. 青海医药杂志，2007，37（3）：56-57.
[4] 国家食品药品监督管理局. 六味明目丸标准[J]. 国家药品标准颁布件，批件号：（2011）国药标字ZD-0089号. |
